Alkoholbedingte Hirnschäden beim Menschen

Abstrakt

Chronische übermäßige Alkoholintoxikationen verursachen kumulative Schäden an Geweben und Organen. Wir untersuchten den präfrontalen Kortex (Brodmann-Areal (BA) 9) von 20 menschlichen Alkoholikern und 20 Alter, Geschlecht und postmortalem Delay übereinstimmenden Kontrollpersonen. Die H & E-Färbung und die Lichtmikroskopie von präfrontalem Kortexgewebe zeigten eine Reduktion der Zytoskeletts um die Kerne von kortikalen und subkortikalen Neuronen und eine Störung der subkortikalen Neuronenmuster bei alkoholischen Patienten. BA 9-Gewebehomogenisierung und eindimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -Proteomik von cytosolischen Proteinen identifizierten drastische Reduktionen der Proteinspiegel von Spektrin & beta; II und & alpha; – und & beta; -Tubuline bei Alkoholikern, und diese wurden durch Western-Blotting validiert und quantifiziert. Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der α-Tubulin-Acetylierung bei Alkoholikern, einen nicht signifikanten Anstieg der Isoaspartat-Protein-Schädigung, aber einen signifikanten Anstieg der Protein-Isoaspartyl-Methyltransferase-Proteinspiegel, das Enzym, das die Reparatur von Isoaspartat-Schäden in vivo auslöst. Es gab auch eine signifikante Verringerung der Proteasomenaktivität bei Alkoholikern. Eine eindimensionale PAGE von membranangereicherten Fraktionen zeigte eine Reduktion der & bgr; -Spektrinproteinspiegel und eine signifikante Zunahme der transmembranösen & agr; 3 (katalytischen) Untereinheit der Na +, K + -ATPase bei alkoholischen Subjekten. Die Kontrollsubjekte behielten jedoch stabile oligomere Formen der & agr; -Untereinheit bei, die bei Alkoholikern vermindert waren. Bei Alkoholikern wurde ein signifikanter Verlust von cytosolischen α- und β-Tubulinen auch im Nucleus caudatus, im Hippocampus und im Cerebellum beobachtet, jedoch in unterschiedlichen Konzentrationen, was auf eine regionale Empfindlichkeit des Gehirns gegenüber alkoholbedingten Schäden hinweist. Zusammengenommen stellen diese Proteinveränderungen eine molekulare Grundlage für einige der neuronalen und Verhaltensauffälligkeiten dar, die Alkoholikern zugeschrieben werden.

 

Zitat: Amaia M. Erdozain, Benito Morentin, Lynn Bedford, Emma King, David Tooth, Charlotte Brewer, Declan  Wayne, Laura Johnson, Henry K. Gerdes, Peter Wigmore, Luis F. Callado, Wayne G. Carter
Brewer C, et al. (2014) Alcohol-Related Brain Damage in Humans. PLoS ONE 9(4): e93586. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093586
Editor: Luis Eduardo M. Quintas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil

 

Einführung

Chronischer übermäßiger Alkoholkonsum ist ein globales Gesundheitsproblem mit epidemischem Anteil [1]. Alkoholiker erleben eine Reihe kognitiver Defizite wie Lern- und Gedächtnisdefizite, Beeinträchtigung der Entscheidungsfindung und Probleme mit motorischen Fähigkeiten sowie Verhaltensänderungen, die Angst und Depression einschließen [2], [3]. Diese schwächenden Morbiditäten ergeben sich aus den kumulativen Wirkungen von Intoxikation und Alkoholentzug und können durch Ernährungsdefizite wie Wernicke-Korsakoff-Störungen weiter verstärkt werden [2] – [6].

Übermäßiger Alkoholkonsum kann bei regionaler Hirnatrophie zu einer Reduktion des Hirngewichtes führen [2], [4], [5]. Die Produktion von toxischen Ethanolmetaboliten und ihre posttranslationale Modifikation (PTM) und die Schädigung von zellulären Proteinen ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen, die zu neuronalen Schäden beitragen [5], [7] – [9].

Der erste toxische Metabolit von Ethanol, Acetaldehyd, kann Addukte mit der ε-Aminogruppe von Lysinresten bilden, und es wurde vermutet, dass diese kovalenten Modifikationen die Funktion von Proteinen stören und zu einer zellulären Schädigung führen können [10]. Eines der Hauptziele der Acetaldehyd-vermittelten Adduktion ist α-Tubulin [11], und die ortspezifische α-Tubulin-Acetylierung kann die Mikrotubuli-Polymerisation beeinflussen [10], [11]. Acetaldehyd-Protein-Addukte wurden innerhalb der weißen Substanz, des frontalen Kortex, des Mittelhirns, des Gyrus dentatus und des Kleinhirns in mit Ethanol gefütterten Ratten und im frontalen Kortex und Mittelhirn eines Alkoholikers nachgewiesen [7] – [9]. Darüber hinaus kann der Alkoholmetabolismus auch die Produktion von schädlichen Proteinaddukten aus Produkten der Lipidperoxidation auslösen, einschließlich 4-Hydroxy-2-Nonenal (4-HNE), die Tubuline binden und den Verlust von Mikrotubuli durch eine Erhöhung ihrer Unlöslichkeit auslösen kann. 12] – [14].

In der Leber erhöht der Ethanolkonsum auch die Proteinschädigung als Isoaspartat durch den Einfluss von Ethanol auf den Methionin-Stoffwechselweg [15], [16]. Ethanolverbrauch löst eine Verringerung der Spiegel des Methyldonors S-Adenosylmethionin (SAM) und eine Erhöhung der Spiegel des Metaboliten S-Adenosylhomocystein (SAH) aus. Dieses reduzierte SAM: SAH-Verhältnis hemmt die Aktivität vieler Methyltransferasen, einschließlich der Protein-Isoaspartyl-Methyltransferase (PIMT), eines Enzyms, das die Reparatur von durch Isoaspartat geschädigten Proteinen auslöst [17] – [19]. Es muss jedoch noch bestimmt werden, ob ein ähnlicher Mechanismus der Ethanol-induzierten Inhibition von PIMT und der Erhöhung von Isoaspartat-Schäden in Gehirngewebe existiert.

Regionale Hirnalkohol-induzierte Pathologie kann sich auf die Motor-Neuronen-Funktion auswirken und auch das kognitive Verhalten beeinflussen. In einem Versuch, Proteinschädigung innerhalb einer Gehirnregion, die in kognitives und soziales Verhalten involviert ist, zu untersuchen, untersuchten wir zuerst postmortales Hirngewebe aus dem präfrontalen Kortex (Region BA 9) von 20 menschlichen Alkoholikern und 20 Alter, Geschlecht und postmortalem Delay übereinstimmenden Kontrollpersonen. Wir verglichen die Histologie von Kontroll- und alkoholischem neuronalem Gewebe und verwendeten dann Protein-Profiling, um prominente Veränderungen des neuronalen Gewebeproteins zu identifizieren. Eine Identifizierung der wichtigsten Veränderungen im Gehirnprotein lieferte einen Einblick in strukturelle Schäden in den Gehirnen von Alkoholikern, für die funktionelle Defizite extrapoliert wurden.
Materialen und Methoden
Human Brain Samples und Ethik-Erklärung

Die in dieser Studie verwendeten humanen postmortalen Proben gehören zur Gehirnsammlung der Neuropsychopharmacology Research Group am Department of Pharmacology der Universität des Baskenlandes (UPV / EHU). (http://www.farmacologia.ehu.es/s0026-home/en/contenidos/informacion/s0026_presentacion/en_farm/presentacion.html).

Die Gehirnsammlung ist im Nationalen Biobank-Register des Spanischen Gesundheitsministeriums unter der Nummer C.0000035 (https://biobancos.isciii.es/ListadoColecciones.aspx) registriert. Menschliche Gehirne wurden bei Autopsie von 20 alkoholischen und 20 Kontrollpersonen im Baskischen Institut für Rechtsmedizin, Bilbao, Spanien, erhalten. Die Gehirnsammlung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Forschung und der Ethikkommission für postmortale Gehirnstudien (Baskisches Institut für Rechtsmedizin, Bilbao) entwickelt. Die spanische Gesetzgebung zum Zeitpunkt der Probenentnahme erforderte keine schriftliche Einverständniserklärung des nächsten Angehörigen für die Verwendung dieser postmortalen Proben in der Forschung. Darüber hinaus ist die Analyse von postmortalen Gehirnproben nicht als menschliche Forschung durch die Vorschriften des US-Gesundheitsministeriums (DHHS) und der FDA (Food and Drug Administration) definiert.

Die Diagnose von Alkoholismus wurde gemäß dem Diagnostischen und Statistischen Handbuch der Psychischen Störungen (DSM-III-R, DSM-IV oder DSM-IV-TR; American Psychiatric Association) oder Internationale Klassifikation der Krankheiten Kriterien (ICD-10; World Gesundheitsorganisation). Alle Diagnosen wurden von Klinikern erstellt, die für die Patienten vor dem Tod verantwortlich waren. Diese Gruppe umfasste 20 alkoholische Personen ohne weitere diagnostizierte psychiatrische Erkrankung. Jeder alkoholische Fall wurde sorgfältig auf Geschlecht, Alter und postmortale Verzögerung mit einem Kontrollsubjekt abgestimmt, das durch plötzliche und gewalttätige Ursachen starb, ohne eine Vorgeschichte von irgendeiner neurologischen oder psychiatrischen Störung. Für jeden Studienteilnehmer wurde ein bluttoxikologisches Screening auf Alkohol und Psychopharmaka durchgeführt. Die Tabellen 1 und 2 fassen die demographischen Merkmale und die Arzneimittelgeschichte der Probanden zusammen, die in den mikroskopischen bzw. biochemischen Studien enthalten sind. Proben aus der BA 9 Region wurden zum Zeitpunkt der Autopsie makroskopisch seziert und entsprechend der Art der Studie verarbeitet. Gehirnproben von 10 übereinstimmenden Paaren der Fallkontrolle wurden für die Mikroskopie verarbeitet, und Gehirnproben von weiteren 10 passenden Fall-Kontroll-Paaren wurden sofort eingefroren und bei -80 ° C gelagert, bis sie für biochemische Studien benötigt wurden. Für 5 Paare von BA9-Proben, die für biochemische Studien verwendet wurden, wurden auch zusätzliches teilnehmendes Hirngewebe aus dem Nucleus caudatus, Hippocampus und Cerebellum erhalten.

 

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Tabelle 1. Demographische Merkmale, postmortale Verzögerung (PMD), Todesursache und bluttoxikologisches Screening der Kontroll- (C) und alkoholischen (A) Probanden, analysiert mit Lichtmikroskopie.

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Tabelle 2. Demographische Merkmale, postmortale Verzögerung (PMD), Todesursache und bluttoxikologisches Screening der Kontroll- (C) und alkoholischen (A) Personen, die für biochemische Studien verwendet wurden.
Hirngewebe Schnitte und Mikroskopie

Hirngewebe wurden mit einem Microm HM 550-Kryostaten auf 8 μm Dicke kryokorrigiert und dann auf Glasobjektträger aufgebracht und mit H & E angefärbt. Hirngewebsschnitte wurden unter Verwendung eines Leica DM4000B-Lichtmikroskops mit einem 100 × / 1,25NA, 50 × / 0,9, abgebildet NA, 20x / 0.4NA oder 10x / 0.25NA N Objektiv planen. Bilder wurden von einer MicroPublisher 3.3RTV-Kamera (QImaging) aufgenommen, die von der OpenLab-Software (Improvision / PerkinElmer) gesteuert wurde. Regionale Bilderfassung und -analyse wurden für alle Kontroll- und alkoholischen Proben durchgeführt, für die repräsentative Bilder von einem Kontroll- und alkoholkranken Paar in Abbildung 1 enthalten sind.http://journals.plos.org/plosone/article/figure/image?size=medium&id=info:doi/10.1371/journal.pone.0093586.g001

Figure 1. Histological examination of prefrontal cortex neuronal cells from controls and alcoholics.
Cortical pyramidal cells (upper two panels), and subcortical neurons (lower two panels) of control and alcoholic tissue sections were visualised by light microscopy. White bar represents 50 μm for 10x, 10 μm for 50x, and 5 μm for 100x lenses. Examples of the differences in the cytoplasm surrounding the nuclei of cells from alcoholic or control tissue sections have been marked with white arrows. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093586.g001

Brain Tissue Homogenisation

Brain tissue samples (∼100 mg) were homogenised at 4°C in 20 volumes of phosphate buffer (200 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7.4) containing protease inhibitor cocktail (Sigma), using an Ultra-Turrax T8 homogeniser (IKA Labortechnik, Germany). Homogenates were centrifuged at 500×g for 10 min at 4°C in a benchtop centrifuge to pellet the nuclear fraction. The supernatant was then centrifuged at 21,300×g for 40 min at 4°C to produce a crude cytosolic preparation. The pellet from this centrifugation, corresponding to the plasma membrane enriched fraction, was resuspended in 10 volumes of the homogenisation buffer. Nuclear, cytosolic, and membrane enriched fractions were flash-frozen and stored at −80°C until required. Protein concentration in cytosolic and membrane fractions was determined by Lowry protein assay (DC, BioRad, UK) using bovine serum albumin (BSA) as a protein standard.

One Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis (1D-PAGE)

Protein homogenate was separated on 10% Bis-Tris NuPAGE Novex pre-cast gels (20 μg/gel lane) run with 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) running buffer as described previously . Resolved proteins were either stained with colloidal Coomassie blue and then densitometry performed using an Odyssey laser scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), or proteins electroblotted at 80 V for 2 hours to a polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore) membrane for Western blotting. All protein homogenates were resolved 2–3 times by gel electrophoresis, and differentially expressed proteins excised from gels and identified by mass spectrometry. Similarly, protein extracts were all resolved 2–3 times for Western blotting analysis, with representative figures from protein staining and blotting experiments included as Figures.

Matrix Assisted Laser-desorption Ionisation-time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Differentially stained proteins were excised from gels and analysed by MALDI-TOF mass spectrometry using a Micromass MALDI (Waters, UK) as described previously .

Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry (LC MS/MS)

Tryptic peptides from excised protein bands were run on a Waters QTOF2 hybrid quadrupole mass spectrometer incorporating an integrated capillary LC system as described previously. Further details detailing peptides identified by MALDI-TOF mass spectrometry and LC MS/MS are included as Data S1.

Western (immuno) blotting: PVDF membranes were stained with Coomassie blue (Safestain, Invitrogen), and then destained with 50% methanol (v/v), 10% acetic acid (v/v) to visualise proteins, and ensure even protein transfer across the blot. Membranes were then washed in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.05% (v/v) Tween 20 (PBS-T), blocked for 1 h at room temperature with 5% (w/v) milk protein in wash buffer, and then incubated overnight at 4°C with the primary antibody of interest in blocking buffer. The antibodies used in this study were directed against the following proteins, and at the dilutions specified: goat polyclonal to spectrin β II (Santa Cruz, sc-7468) at 1∶250; rabbit polyclonal to β-tubulin (Santa Cruz, sc-9104) at 1∶250; mouse monoclonal to α-tubulin (Santa Cruz, sc-8035) at 1∶250; mouse monoclonal to acetylated α-tubulin (Santa Cruz, sc-23950) at 1∶250; mouse monoclonal to protein-L-isoaspartate O-methyltransferase (Santa Cruz, sc-100977) at 1∶500; rabbit polyclonal to actin (Santa Cruz, sc-1616-R) at 1∶1000; mouse monoclonal to the α1 catalytic subunit of the Na+,K+-ATPase (Abcam, ab7671) at 1∶500. A mouse monoclonal antibody to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Abcam, ab8245) was used at 1∶3000 as a gel loading control for cytosols, and rabbit polyclonal to actin (Santa Cruz, sc-1616-R) at 1∶1000 as a gel loading control for membrane fractions. Blots were washed in PBS-T and then incubated for 1 hour at room temperature with their corresponding horseradish peroxidase conjugated anti-species secondary antibody (polyclonal goat anti-rabbit, goat anti-mouse or rabbit anti-goat immunoglobulins, all purchased from Dako, products P0448, P0447, P0449 respectively) at 1∶1000 dilution in PBS-T. Antibody immunoreactivity was visualised using SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate (Pierce) with the light generated captured on CL-Xposure X-ray film (Pierce), or using a Chemi Doc device (Bio-Rad). Films were densitometrically scanned using a CanoScan LiDE 700F flatbed scanner (Canon), and the levels of proteins quantified using the public domain image processing program ImageJ, developed at the National Institutes of Health. Alternatively, blots were quantified using QuantityOne software intrinsic to the Chemi Doc charge-coupled device. The results are expressed as GAPDH or actin normalised values. The mean signal density for quantitation of control samples was set at 100% of protein signal. Blots probed for multiple antibody analyses were intermittently antibody stripped with stripping buffer (Restore, Thermo Scientific) by shaking at 125 rpm at 50°C for 30 minutes.

Quantification of Isoaspartate Levels

The level of isoaspartate in control and alcoholic cytosolic extracts was quantified based upon the method of Aswad and Deight [21]. Protein extracts (100–200 μg of protein) were incubated in a final reaction volume of 100 μl, containing 40 mM K-MES, pH 6.2, 20 μM S-Adenosyl-L-[3H-methyl]methionine (3H-SAM) (8250 dpm/pmol, final specific activity), and 2 μM recombinant PIMT (Promega). Methylation reactions were initiated by the addition of PIMT and incubation for 30 minutes at 30°C. Methylation was terminated by the addition of 1 ml of ice-cold 7% (w/v) trichloroacetic acid (TCA), and protein precipitation on ice for 10 minutes. Protein precipitate was retained by centrifugation for 5 minutes in a refrigerated centrifuge (Eppendorf 5415R) at maximum speed (16 100×g). The supernatant containing unincorporated 3H-SAM was removed to waste, and then the precipitate washed with 100 μl of 88% (v/v) formic acid. One ml of 7% TCA was added and protein precipitation performed as before. Precipitate was again collected by centrifugation and extraneous unincorporated 3H-SAM removed. The pellet was washed as previous with 100 μl of 88% (v/v) formic acid, and then precipitation with 1 ml of 7% TCA repeated. The protein precipitate was then solubilised in 100 μl of 0.5 M NaOH, 1% (v/v) methanol, 5% (v/v) Triton X-100, and transferred to 10 ml of scintillant and counted for radioactivity incorporation using a Packard Tri-Carb counter. Replicate assays were performed for all assay points from which an average value of radiolabel incorporation determined. Radiolabel incorporation into brain extracts in the absence of PIMT addition, due to endogenous methylation was subtracted from assay values. Isoaspartate quantitation was performed on the 10 matched pairs of control and alcoholic brains.

Proteasome Activity Assay

Control or alcoholic brain tissue was homogenised in a buffer of 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT at 4°C. The homogenate was centrifuged at 10, 000×g to pellet cellular debris, and the supernatant transferred to a fresh eppendorf. Fifty μg of homogenate was assayed for proteolytic activity against N-succinnyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-methyl-coumarin by fluorimetry (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 460 nm). Fluorescent assays were performed in duplicate from which an average value was obtained.

Statistics

Statistical comparison between data means was performed using a Student’s t-test using GraphPad Prism 4 software, with results expressed as means ± SEM. A p value of <0.05 was regarded as statistically significant.

Results

Histological Examination of Prefrontal Cortex Neuronal Cells from Controls and Alcoholics

To assess the presence of structural changes within BA 9 tissue that may arise from cumulative ethanol intoxications, we examined cells within brain tissue slices from 10 alcoholics and 10 control subjects matched for age, gender and postmortem delay – refer to Table 1. Light microscopy of cells within the cortical pyramidal cell layers revealed that cells from alcoholics exhibited disrupted cytoplasm surrounding their nuclei. These differences were particularly evident with a 100x lens – refer to arrows in Figure 1, upper two panels. An examination of subcortical neurons within the white matter of the alcoholic brain tissue slices also highlighted a reduction in the level of organised cytoplasm surrounding the nuclei. Additionally, subcortical neurons from alcoholics lacked the ordered parallel arrangement of cells seen with control subjects. These differences were well distinguished with a 50x lens – refer to arrows in Figure 1, lower two panels.

Profiling of Cytosolic Proteins from the Prefrontal Cortex of Control and Alcoholic Subjects and Western Blotting

To investigate further the reduced and disorganised cytoplasm or cytoskeleton observed for alcoholic brain tissue, we homogenised BA 9 tissue from control and alcoholics and examined protein profiles by 1D PAGE. Due to limited sample availability, and to further validate this observation with more subjects, 1D PAGE was performed with an additional population of 10 matched control and alcoholic subjects, the details of which are listed in Table 2. Visual inspection of 1D PAGE protein profiling of cytosolic proteins revealed only two major recurrent protein level differences between control and alcoholic groups. There was a prominent reduction in the level of an ∼270 kDa protein and an ∼50 kDa protein, and these changes were visible in all alcoholics when compared to their control matched counterparts – refer to Figure 2, upper section. Protein bands at these molecular weights from six individuals were removed and proteins identified by mass spectrometry. The ∼270 kDa protein band was identified as spectrin β II, and the ∼50 kDa protein band identified as a mixture of peptides from different forms of α-tubulin and β-tubulin – refer to Table 3 and Data S1.

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Abbildung 2. Profilierung von zytosolischen Proteinen aus dem präfrontalen Kortex von Kontroll- und Alkoholikern.
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Kontroll- (C) oder alkoholische (A) präfrontale Kortexzytosolproteine wurden durch 1D-PAGE aufgelöst und Proteine mit kolloidalem Coomassie gefärbt. Alkoholiker zeigten eine deutliche Abnahme der Proteinfärbung bei Proteinbanden von ~ 270 kDa und ~ 50 kDa (oberes Feld). Die Proteinspiegel wurden durch Western-Blot sichtbar gemacht (unteres Feld). Abkürzungen: GAPDH, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; PIMT, Protein-L-Isoaspartat-O-Methyltransferase.

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Table 3. Massenspektrometrische Identifizierung differentiell exprimierter Proteine aus dem präfrontalen Kortex von Kontroll- und Alkoholikern.

Um diesen dramatischen Verlust der Zytoskelettproteine β-Spectrin und α- und β-Typ-Tubuline spezifisch innerhalb des alkoholischen Hirngewebes zu validieren und zu quantifizieren, untersuchten wir deren Proteinspiegel mittels Western Blotting – Abbildung 2 unten. Western-Blot-Analysen bestätigten eine signifikante 36% ige Abnahme von Spektrin & bgr; II (p = 0,0002), signifikante 56% Abnahme von & agr; -Tubulin (p = 0,0017) und signifikante 83% Abnahme von & bgr; -Tubulin-Spiegeln (p <0,0001) für die 10 alkoholische Versuchspersonen – Fig. 3. Die alkoholischen Versuchspersonen, bei denen die Konzentration von α- oder β-Tubulinen unter der Nachweisgrenze des Western-Blots lag, wurden als 100% Proteinverlust ausgedrückt. Cytosolische GAPDH-Spiegel waren in allen untersuchten Kontroll- und Alkoholproben stabil und wurden zur Proteinnormalisierung verwendet.

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Abbildung 3. Quantifizierung der Unterschiede in Protein und Aktivität zwischen Kontroll- und Alkoholikern.

Die Proteinspiegel wurden durch Western-Blotting quantifiziert, und der Grad der Isoaspartatproteinschädigung und Proteasomenaktivität wurde bestimmt. Zur Quantifizierung des Verhältnisses von acetyliertem & alpha; -Tubulin zu totalem & alpha; -Tubulin ist die Figur repräsentativ für diejenigen Subjekte, die sichtbares Gesamt-& alpha; -Tubulin-Signal zeigten (6 der 10 getesteten Subjekte). Für deutliche Signifikanz: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Abkürzungen: PIMT, Protein-L-Isoaspartat-O-Methyltransferase.

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Das zelluläre Zytoskelett-Netzwerk besteht aus Mikrotubuli, intermediären Filamenten und Mikrofilamenten. Der Hauptproteinbestandteil von Mikrofilamenten ist Aktin, daher quantifizierten wir auch Aktinproteinspiegel, um zu bestimmen, ob der Zytoskelettverlust auf Aktin in Mikrofilamenten ausgedehnt wurde. Die Aktinwerte stiegen bei Alkoholikern um 16%, dies war jedoch nicht signifikant – Abbildungen 2 und 3.
Untersuchung von Protein PTM und Schäden in Kontroll- und Alkohol Gehirngewebe

Wir untersuchten mögliche PTMs von Tubulinen, die möglicherweise zu einer Veränderung ihres zytosolischen Spiegels beigetragen haben oder die Stabilität oder den Umsatz von Tubulin beeinflussen können. Wir quantifizierten das Niveau von acetyliertem α-Tubulin in allen cytosolischen Proteinproben durch Western-Blotting mit einem Antikörper, der spezifisch acetyliertes Lysin-40- 2 erkennt. Der relative Anteil von acetyliertem α-Tubulin zu Gesamt-α-Tubulin wurde als signifikant quantifiziert % Anstieg (p = 0,0094) für alkoholische Probanden im Vergleich zu ihren entsprechenden Kontrollen – Abbildung 3.

Zweitens können α- und β-Tubuline eine Isoaspartat-Schädigung in vivo akkumulieren, wenn die PIMT-Aktivität inhibiert oder entfernt wird. Wir quantifizierten die Spiegel des totalen Isoaspartat-Proteinschadens in den cytosolischen Proteinen von Kontroll- und Alkoholgehirnen und auch die Werte des cytosolischen PIMT-Enzyms durch Western-Blotting – Figuren 2 und 3. Es gab einen 9% igen Anstieg der gesamten cytosolischen Isoaspartatspiegel innerhalb des Alkoholikers Gehirne aber das hat keine Bedeutung erreicht. Im Gegensatz dazu gab es einen signifikanten Anstieg von 28% (p = 0,0438) in cytosolischen PIMT-Proteinspiegeln bei Alkoholikern. Aufgrund der relativ geringen Gesamtmenge an Isoaspartat in Kontroll- oder Alkoholgehirnen wurde eine Untersuchung der spezifischen Spiegel von Isoaspartatproteinschäden innerhalb von α- und β-Tubulinen nicht vorgenommen.

Der Proteasom-Komplex ist verantwortlich für den Umsatz der meisten zytosolischen Proteine ​​einschließlich Tubuline. Daher quantifizierten wir auch die proteasomale Aktivität von Hirngewebe von den 10 Kontroll- und 10 Alkoholikern. Die proteasomale Aktivität der alkoholischen Probanden nahm signifikant um 25% ab (p = 0,0426) – siehe Abbildung 3.

Wir untersuchten auch die Konzentrationen von α- und β-Tubulin innerhalb von Kern- und Membranfraktionen, um zu bestimmen, ob die bei Alkoholikern beobachteten reduzierten cytosolischen Proteinspiegel durch Proteintranslokation in diese anderen zellulären Kompartimente entstanden sind. Nach 1D-PAGE und Western-Blotting gab es keine signifikanten Veränderungen der Konzentrationen von α- oder β-Tubulinen in den Kern- oder Membranfraktionen von alkoholischem Hirngewebe im Vergleich zu Kontrollpersonen. Dies legt nahe, dass der α- und β-Tubulin-Proteinverlust im präfrontalen Kortex von Alkoholikern auf das Cytosol beschränkt ist.

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Fig. 4. Western Blot von α- und β-Tubulinen in Kern- und Membranfraktionen aus dem präfrontalen Kortex von Kontroll- und Alkohol-Subjekten.

Kontroll- (C) oder alkoholische (A) Präfrontalkortex-Kern- und -Membranfraktionen wurden durch 1D-PAGE aufgelöst und Proteine ​​Western-Blotting für α- und β-Tubuline.

Profilierung von Membranfraktionsproteinen aus dem präfrontalen Cortex von Kontroll- und Alkoholikern

Eindimensionale PAGE-Profilierung von Proteinen aus den Membranfraktionen von Kontroll- und Alkohol-Subjekten führte zum Nachweis von zwei visuell prominenten Proteinveränderungen. Es gab eine Verringerung der Proteinmengen eines ~ 270 kDa Proteins bei alkoholischen Subjekten und eine Erhöhung der Niveaus eines Protein Dubletts bei ~ 112 kDa Protein – obere Abbildung 5. Proteinbanden mit diesen Molekulargewichten von 5 Kontroll- und 5 alkoholischen Subjekten wurden aus Gelen herausgeschnitten und durch Massenspektrometrie analysiert. Ähnlich wie bei der zytosolischen Proteinanalyse wurde das reduzierte ~ 270 kDa-Protein als Spektrin & bgr; II identifiziert. Beide Proteindoublet-Banden bei ~112 kDa-Protein wurden als die α3-Untereinheit der Na +, K + -ATPase identifiziert – siehe Tabelle 3 und Daten S1.

 

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Abbildung 5. Profilierung von Membranfraktionsproteinen aus dem präfrontalen Kortex von Kontroll- und Alkoholikern.
Kontroll- (C) oder alkoholische (A) präfrontale Cortex-Membranfraktionsproteine ​​wurden durch 1D-PAGE aufgelöst und Proteine ​​mit kolloidalem Coomassie angefärbt. Alkoholische Subjekte zeigten bei einer Proteinbande von ~ 270 kDa und einer Hochregulation bei ~ 112 kDa eine deutliche Verringerung der Proteinfärbung (oberes Feld). Die Proteinspiegel der transmembranären (~ 112 kDa) Na +, K + -ATPase & agr; -Untereinheit und der oligomeren Formen der & agr; -Untereinheit wurden durch Western-Blotting sichtbar gemacht (mittleres Feld). Das Niveau der transmembranen α-Untereinheit wurde unter Verwendung von Aktin zur Normalisierung quantifiziert (unteres Feld). Für deutliche Signifikanz: *** = p <0,001.

In Übereinstimmung mit den Proteinfärbungsdaten für die Na +, K + -ATPase & agr; -Untereinheit bestätigte das Western Blotting eine breitere Immunreaktivität der monomeren, membranassoziierten & agr; -Untereinheit bei alkoholischen Probanden; quantifiziert als eine kombinierte 31% signifikante Zunahme (p = 0,0002). Western-Blotting zeigte auch, dass oligomere Formen der & agr; -Untereinheit, die in Kontrollsubjekten vorhanden waren, bei Alkoholikern praktisch nicht vorhanden waren, was auf ein funktionelles Defizit bei der & agr; -a-Oligomerisierung hindeutet – 5 mittlere und untere Felder.
Profilierung von zytosolischen Proteinen aus dem Nucleus caudatus, Hippocampus und Kleinhirn von Kontroll- und Alkoholikern

Wir wollten herausfinden, ob der Verlust von α- und β-Tubulinen in alkoholischen Gehirnen ein regionales Phänomen ist, das auf den präfrontalen Kortex beschränkt ist. Daher untersuchten wir für die Gehirnregionen, für die wir auch Zugang zu weiteren Geweben hatten, die Gehalte an cytosolischen α- und β-Tubulinen in Nucleus caudatus, Hippocampus und Cerebellum aus 5 übereinstimmenden Kontroll- und Alkoholpaaren (Einzelheiten in der Tabelle) 2). Cytosolische Proteine ​​von jeder der Hirnregionen wurden durch 1D-PAGE aufgelöst und mit den spezifischen Anti-α- und Anti-β-Tubulin-Antikörpern Western-Blotting unterzogen – obere und mittlere Platten von Fig. 6.

http://journals.plos.org/plosone/article/figure/image?size=medium&id=info:doi/10.1371/journal.pone.0093586.g006

Abbildung 6. Profilierung von zytosolischen Proteinen aus dem Nucleus caudatus, Hippocampus und Kleinhirn von Kontroll- und Alkoholikern.
Kontroll- (C) oder alkoholische (A) cytosolische Proteine ​​aus Nucleus caudatus, Hippocampus und Cerebellum wurden durch 1D-PAGE aufgelöst und Proteine ​​mit kolloidalem Coomassie gefärbt (oberes Feld). Die Positionen der ~ 50 kDa α- und β-Tubulin-Proteinbanden sind mit Pfeilen markiert. Cytosolische Proteine ​​wurden Western-Blotting für α- und β-Tubulin und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (mittleres Feld), und Protein-Level-Veränderungen quantifiziert mit GAPDH für die Normalisierung (untere Panel). Für deutliche Signifikanz: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093586.g006

Die Quantifizierung von Western Blots zeigte eine signifikante Reduktion der Gesamtmenge an α- und β-Tubulinen in allen Gehirnregionen, aber das Ausmaß der Reduktion war regionspezifisch. Es gab eine signifikante Abnahme von 30% (p = 0,0198) in & alpha; -Tubulin und eine signifikante Abnahme von 31% (p = 0,0081) in & beta; -Tubulin im Nucleus caudatus. Es gab eine signifikante 50% (p = 0,0004) und 47% (p = 0,0054) Abnahme von α- bzw. β-Tubulin im Hippocampus, und signifikante 54% (p = 0,0044) und 36% (p = 0,0486) Abnahme von α- und β-Tubulin im Kleinhirn. Der präfrontale Kortex zeigte jedoch die größten Verringerungen von α-Tubulin (56% Abnahme, p = 0,0002) und β-Tubulin-Spiegel (84%, p <0,0001) – Fig. 6 untere Felder.
Diskussion

Eine Untersuchung der molekularen Anomalien, die als Folge von kumulativen Ethanolintoxikationen auftreten, wird dabei helfen, die Entwicklung der Gewebepathologie zu verstehen. Darüber hinaus kann eine Charakterisierung von Ethanol-induzierten molekularen Veränderungen auch einen Einblick in die molekularen Anpassungen geben, die mit Toleranz, Abhängigkeit und Verhaltensauffälligkeiten eines Alkoholikers assoziiert sind. Zusammengenommen wird die Forschung auf diesem Gebiet eine Grundlage für zielgerichtete Therapeutika bilden, die der schwächenden Morbidität entgegenwirken und die Inzidenz der Mortalität senken.

Wir untersuchten Alkohol-assoziierte neuronale Gewebeschädigung des präfrontalen Kortex mit Lichtmikroskopie und waren fasziniert, um eine klare histologische Unterscheidung zwischen Zellen von Alkoholikern und ihren übereinstimmenden Kontrollen zu sehen. Dies führte uns dazu, eindimensionale Proteinprofilierung von zytosolischen Proteinen von Alkoholikern und Kontrollen durchzuführen, und wir identifizierten die Hauptproteinverluste wie diejenige von α- und β-Tubulinen und Spektrin β-Kette.

Alpha- und β-Tubuline lokalisieren sich als Heterodimere und sind Hauptkomponenten von Mikrotubuli. Mikrotubuli sind nicht-kovalente Zytoskelett-Polymere, die ein zelluläres Proteinnetzwerk bereitstellen. Mikrotubuli beeinflussen Zellform, Motilität und Stabilität und sind von zentraler Bedeutung für das Funktionieren zahlreicher zellulärer Prozesse einschließlich Mitose und vesikulärem Transport [26], [27]. Mikrotubuli existieren sowohl als dynamische als auch als stabile Polymere, wobei Übergänge zwischen diesen Zuständen in Subpopulationen von Mikrotubuli durch PTMs und Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​(MAPs) beeinflusst werden [26, 27]. Daher würde erwartet werden, dass der Verlust von funktionellen Tubulinen, der in dem BA 9 -Gewebe von Alkoholikern gesehen wird, zu einer Störung des Zytoskelett-Netzwerks führt und die vielen zellulären Transportprozesse beeinflusst, die an die Zytoskelett-Architektur gebunden sind.

Ähnlich wie Tubuline sind Spektrine eine Familie von Proteinen, die wichtige strukturelle Komponenten des Zytoskeletts sind. Spektren (als α- und β-Heterodimere) fungieren als molekulare Gerüste, die mit der cytoplasmatischen Oberfläche der Plasmamembran assoziieren und ein molekulares Gitter bilden, das die Plasmamembran mit Aktin und dem Mikrotubuli-Zytoskelett verbindet. Spektrenfunktionen umfassen die Aufrechterhaltung der Zellform und die Anordnung von Transmembranproteinen. Darüber hinaus funktionieren Gehirnspektren in der Assoziation von Vesikeln mit dem Mikrotubularnetzwerk und beeinflussen die Stabilisierung und Freisetzung von synaptischen Vesikeln. Daher würde die Verringerung der Spektrenspiegel, die bei alkoholischen Probanden beobachtet wird, wahrscheinlich zelluläre Transportprozesse und die Auslösung von synaptischen Neurotransmissionsereignissen stören.

Zusammenfassend schlagen wir vor, dass eine Reduktion der Zytoskelettarchitektur eine Grundlage für die tiefgreifenden Unterschiede in der neuronalen Histologie des präfrontalen Kortex von Alkoholikern darstellt und wahrscheinlich zu den kognitiven und Lernstörungen beiträgt, die Alkoholiker erfahren.

Als nächstes untersuchten wir molekulare Mechanismen, die die selektive Schädigung und den Verlust dieser Zytoskelettproteine ​​bei Alkoholikern erklären könnten. Ethanol kann im Cytosol über die Wirkung von Alkoholdehydrogenase in Acetaldehyd umgewandelt werden, und im Gehirn kann diese Umwandlung auch durch Katalase und Cytochrom P450-Enzyme vorgenommen werden. Acetaldehyd ist eine reaktive Verbindung und fügt leicht eine Reihe von zytosolischen Proteinen einschließlich Tubulinen hinzu. Wir haben eine 1,5-fache Zunahme des Verhältnisses von acetyliertem & alpha; -Tubulin zu Gesamt-& alpha; -Tubulin bei den Alkoholikern festgestellt. Ebenso eine Erhöhung des relativen Anteils von acetyliertem α-Tubulin (an Gesamt-α-Tubulin) innerhalb von Leber- oder Leberzellen als Folge von

von Ethanolverbrauch oder -exposition wurde berichtet. In der Leber beeinflusst diese erhöhte α-Tubulin-Acetylierung die Mikrotubuli-Hyperstabilisierung und Inertheit mit einer damit verbundenen Beeinträchtigung des Proteintransports, aber der Einfluss des Ethanolkonsums auf Acetyltransferasen oder Deacetylasen von Gehirn-Tubulin und die funktionellen Konsequenzen einer erhöhten Tubulin-Acetylierung sind bisher nicht bekannt .

Eine weitere potentielle Quelle von Ethanol-induzierten Schäden an α- und β-Tubulin könnte durch eine Erhöhung ihrer Proteinschädigung als Isoaspartat auftreten. Wir fanden einen Anstieg der gesamten cytosolischen Isoaspartat-Konzentrationen um 9% in den alkoholischen Gehirnen, obwohl dies keine Signifikanz erreichte. Es ist immer noch machbar, dass Isoaspartatspiegel spezifisch innerhalb von & agr; – ​​und & bgr; -Tubulinen signifikant ansteigen können, aber da die Gesamtspiegel von zellulärem Isoaspartat niedrig waren, wurde eine Quantifizierung einzelner Protein-Isoaspartatniveaus nicht versucht.

Ein Anstieg des Isoaspartat-Proteinschadens bei alkoholischen Subjekten könnte durch Hochregulierung von zellulären PIMT-Spiegeln ausgeglichen werden, um eine Isoaspartat-Reparatur auszulösen. Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der cytosolischen PIMT-Proteinspiegel in alkoholischem Gewebe um 28%. In ähnlicher Weise berichtete eine proteomische Studie von Veränderungen des synaptischen Proteoms im oberen frontalen Gyrus (SFG) und im occipitalen Kortex (OC) des Kontroll- und alkoholischen postmortalen Gewebes einen signifikanten 30% igen Anstieg der PIMT-Proteinspiegel im SFG und einen 50% igen Anstieg des PIMT-Proteins Ebenen im OK alkoholischer Probanden [34]. Der molekulare Mechanismus, durch den PIMT-Proteinspiegel erhöht sind, muss noch bestimmt werden, und es wird von Interesse sein festzustellen, ob es ein kompensatorisches Mittel widerspiegelt, um einem Anstieg der zellulären Stress- und Isoaspartatproteinschädigung entgegenzuwirken.

Der 26S-Proteasomkomplex ist die vorherrschende zelluläre Protease, die Proteine ​​nach ihrer vorherigen Ubiquitinierung zum Abbau anvisiert. Zusätzlich können oxidierte, modifizierte und / oder beschädigte Proteine ​​auch direkt durch 20S-Proteasomen abgebaut werden. Daher ist ein möglicher Mechanismus, um den Verlust dieser Zytoskelettproteine ​​zu erklären, der, dass Ethanol PTMs und Proteinschäden induziert, was die Proteineliminierung durch das Proteasom auslöst. Bei der Quantifizierung gab es jedoch einen signifikanten Rückgang der Proteasomenaktivität des alkoholischen Gewebes um 25%. Obwohl das Proteasom auf die Clearance dieser Proteine ​​gerichtet sein könnte, wurde seine globale zelluläre Aktivität in den Gehirnen von Alkoholikern beeinträchtigt.

Die verringerten Konzentrationen an cytosolischen Proteinen spiegelten die Translokation zu den Kern- oder Membranfraktionen nicht wider. Das Protein-Profiling der Membranfraktion zeigte auch, dass Spektrin & bgr; II in der membranangereicherten Fraktion von Alkoholikern in einem verringerten Ausmaß vorhanden war. Die membranassoziierte α-Untereinheit der Na +, K + -ATPase wurde sichtbar gemacht und als zwei Proteinbanden mit ähnlichem Molekulargewicht nachgewiesen. Western-Blotting ermöglichte es uns, einen signifikanten Anstieg des Transmembran-Niveaus der α-Untereinheit der Na +, K + -ATPase zu quantifizieren, was vermutlich die Immunreaktivität beider Banden des Protein-Dubletts widerspiegelte.

Die Na +, K + -ATPase katalysiert die Hydrolyse von ATP, gekoppelt an den asymmetrischen Austausch von intrazellulärem Na + für extrazelluläres K + über die Plasmamembran und beteiligt sich an der Erzeugung und Aufrechterhaltung eines Membranpotentials. Native Na +, K + -ATPase ist heterotrimer und besteht aus drei Untereinheiten: α, β und γ. Die α-Untereinheit ist die katalytisch aktive ionentransportierende Untereinheit. Die α1-Isoform ist ubiquitär verteilt, während die α3-Isoform in Neuronen exprimiert wird.

Western-Blotting mit dem Na +, K + -ATPase & agr; -Untereinheits-Antikörper zeigte, dass stabile (oligomere) Formen der & agr; -Untereinheit, die in den Kontrollen vorhanden waren, bei alkoholischen Subjekten abwesend waren (oder gerade bei langen Western-Blot-Aufnahmen sichtbar waren). Die Existenz von α-α-Oligomeren, die gegenüber SDS-PAGE-Bedingungen resistent sind, wurde von unabhängigen Gruppen dokumentiert.

Ethanol-Exposition kann teilweise die Na +, K + -ATPase-Pumpenaktivität im Kleinhirn von Ratten hemmen, obwohl der genaue Mechanismus für die Pumpenhemmung noch nicht definiert ist. Defekte Na +, K + -ATPase & agr; -Untereinheiten führen zu einem schnell einsetzenden Dystonie-Parkinsonismus und anderen Verhaltens- und kognitiven Defiziten. Daher ist es provokativ zu postulieren, dass Veränderungen der & agr; -Untereinheitsniveaus oder der Funktion und / oder der Oligomerisierung auch zu einigen der Verhaltenssymptome von Alkoholikern beitragen könnten.

Wir untersuchten auch Gewebe aus zusätzlichen Hirnregionen und fanden eine signifikante Reduktion des α- und β-Tubulin-Proteins im Nucleus caudatus, im Hippocampus und im Cerebellum, jedoch nicht in Bezug auf den Proteinverlust des präfrontalen Kortex. Die unterschiedliche Empfindlichkeit von Hirnregionen könnte eine unterschiedliche Penetranz über die Blut-Hirn-Schranke der toxischen Metaboliten von Ethanol, wie Acetaldehyd und / oder ihrer spezifischen regionalen Produktion, widerspiegeln.

Studienbeschränkungen

Obwohl wir eine quantitative Bewertung der Proteinkonzentrationen mittels Western Blot vorgenommen haben, ist dies nicht ohne methodische Einschränkungen möglich. Antikörperbindung an ein Zielprotein kann aufgrund der Gegenwart von PTMs maskiert oder sterisch behindert sein. Dies liefert eine Erklärung dafür, warum der gegen acetyliertes α-Tubulin gerichtete Antikörper ein höheres Immunreaktivitätssignal aufweist als der gegen das α-Tubulin-Volllängenprotein gerichtete Antikörper – siehe Fig. 2. Daher die Gesamtmenge an Abbau des Cytoskelettproteins im alkoholischen Gehirn Gewebe sind eindeutig signifikant (und sichtbar nach 1D-PAGE und Proteinfärbung sichtbar), aber der Grad des Proteinabbaus kann unter Verwendung von immunologischer Reaktivität möglicherweise überschätzt werden.

Der direkte Vergleich mit anderen proteomischen Studien des Alkoholgewebes aus dem präfrontalen Kortex ist problematisch aufgrund von Unterschieden im Alter der alkoholischen Probanden, der kumulativen Alkoholaufnahme sowie der Variabilität der regionalen Probenahme, der Proteinpräparation und Methodik usw. [45] – [47]. Nichtsdestoweniger haben andere unabhängige zweidimensionale (2D) proteomische Studien auch Reduktionen der Gehalte an α- und β-Tubulinen im Gehirn von Alkoholikern berichtet [45]. In unserer Studie unterscheiden sich die Patienten in vielen Parametern wie der Bluttoxikologie beim Tod, aber durch Abgleich jedes Paares von Kontrollen und Alkoholikern für Alter, Geschlecht und postmortale Verzögerung wurden robuste und universelle Veränderungen der Proteinspiegel und Modifikationen aufgedeckt. Eine substantiellere Proteomanalyse durch 2D-Trenntechniken könnte zusätzliche Proteinpegelveränderungen aufzeigen, jedoch waren wir primär mit prominenten visuellen Unterschieden beschäftigt, für die eine verwandte Funktion postuliert werden könnte; daher wurde eine umfassende 2D-PAGE-Analyse als über den Rahmen dieser primären Veröffentlichung hinausgehend betrachtet. Darüber hinaus nutzen 2D-Proteomanalysen Proteinfraktionierungs- und Proteinpräzipitationsmethoden, um Komponenten des Proteoms für Analysen anzureichern [34], [45] – [47] und dies könnte Proteindifferenzen, die beim primären 1D-PAGE-Screening sichtbar sind, maskieren.

Ein Einblick in Veränderungen im postmortalen Gewebe des frontalen Kortex von alkoholischen Probanden wurde ebenfalls mithilfe von Genarrays bereitgestellt [48] – [50]. Diese Studien dokumentieren zahlreiche Veränderungen in den Genexpressionsniveaus, die eine reduzierte Expression von Elementen des Ubiquitin-Proteasom-Systems bei Alkoholikern einschließen [48] – [50] und eine reduzierte Expression eines Beta-III-Spektrins bei zirrhotischen Alkoholikern [50]. Somit bleibt es wahrscheinlich, dass signifikante Proteinpegeländerungen, die im präfrontalen Kortex von alkoholischen Subjekten nachgewiesen werden, aus der Veränderung von Transkriptions- und Translationsmechanismen resultieren.

Zusammenfassend berichten wir über tiefgreifende Reduktionen der Zytoskelettproteine ​​α- und β-Tubulin und Spektrin β II bei alkoholischen Probanden, die durch Lichtmikroskopie mit veränderter neuronaler Zellorganisation und Zellstrukturierung korrelieren. Die bekannte Anfälligkeit dieser Proteine ​​für eine Proteinschädigung oder für regulatorische PTMs liefert einen mutmaßlichen Mechanismus, um ihren gezielten Verlust von Proteinniveau und -funktion zu erklären. Veränderte Proteinspiegel und PTMs der Zytoskelett-Architektur sowie die Störung der funktionellen Aktivität der Na +, K + -ATPase liefern eine molekulare Grundlage für einige der veränderten neuronalen und Verhaltenserscheinungen von Alkoholikern und können auch zur atrophischen Hirn-Makrostruktur beitragen Das ist phänotypisch für einen Alkoholiker.

 

Development of humans